Infektion von Hühnerembryonen mit einem Virus. Vortrag zum Thema „Methoden zur Infektion von Hühnerembryonen“

Die meisten bekannten Viren haben die Fähigkeit, sich im Hühnerembryo zu vermehren (Abb. 4). Abhängig von der Art des Virus, der Infektionsmethode und den Forschungszielen werden Embryonen im Alter von 8 bis 14 Tagen verwendet. Influenzaviren werden in 9–10 Tagen kultiviert, Pockenimpfstoffe – in 12 Tagen, Mumps – in 7 Tagen Hühnerembryonen. Die Vermehrung des Virus in Hühnerembryonen erfolgt in verschiedene Teile Embryo, der mit den Merkmalen des Tropismus des Virus verbunden ist. Die Technik, einen Virus in einem Hühnerembryo zu züchten, wird im industriellen Anbau häufig eingesetzt.

Die Struktur eines Hühnerembryos und Methoden seiner Infektion: 1 - in das Amnion; 2 - in die Allantoishöhle; 3 - Zoll Dottersack. (Mikrobiologie und Immunologie. Herausgegeben von Vorobyov A.A. - M. - 1999).

Als Membran wird die äußerste extraembryonale Membran bezeichnet, die an die Hülle oder das mütterliche Gewebe angrenzt und daher als Ort des Austauschs zwischen dem Embryo und seiner Umgebung dient Chorion. Bei eierlegenden Arten besteht die Hauptfunktion des Chorions darin, den Atemgasaustausch durchzuführen. Bei Säugetieren ist das Chorion an der Atmung und Ernährung, Ausscheidung, Filtration und Synthese von Stoffen beteiligt. Bei primitiven Organismen ist das Chorion eine sekundäre Membran und bei fortgeschrittenen Organismen die Membran des Fötus. Der Hohlraum zwischen Chorion und Amnion ist die Chorioamnionhöhle.

Amnion(griechisch Amnion), Fruchtblase oder wässrige Membran – eine der embryonalen Membranen in den Embryonen von Reptilien, Vögeln und Säugetieren.

Evolutionär entstand das Amnion, um Embryonen während der Entwicklung außerhalb der aquatischen Umwelt vor dem Austrocknen zu schützen. Daher werden Wirbeltiere, die Eier legen (Reptilien und Vögel), sowie von Reptilien abstammende Säugetiere als Amnioten („Tiere mit Eimembranen“) klassifiziert. Die vorherigen Klassen und Oberklassen der Wirbeltiere (Cephalochordaten, Cyclostome, Fische, Amphibien) legen ihre Eier im Wasser ab und benötigen daher keine Wasserschale. Diese Tierklassen werden in der Gruppe Anamnia zusammengefasst. Im Gegensatz zu Anamnia benötigen Amnioten keine Wasserumgebung zur Reproduktion und frühe Entwicklung Daher haften Amnioten nicht an Gewässern. Dies ist die evolutionäre Rolle des Amnions.

Bei der Geburt von Säugetieren platzt die Wassermembran, das Wasser fließt aus und die Überreste des Amnions am Körper des Neugeborenen werden oft als „Hemd“ bezeichnet, was seit der Antike überall ein Zeichen für Glück und anderen Aberglauben ist Zeiten (daher insbesondere das russische Sprichwort über diejenigen, die „im Hemd geboren“ wurden).

Allantois (von griechisch allantoeids – wurstförmig) ist das embryonale Atmungsorgan höherer Wirbeltiere; Keimmembran, die sich aus dem Hinterdarm des Embryos entwickelt. Darüber hinaus ist die Allantois am Gasaustausch zwischen dem Embryo und dem Embryo beteiligt Umfeld und Freisetzung flüssiger Abfälle. Die Allantois ist zusammen mit anderen embryonalen Membranen – Amnion und Chorion – ein charakteristisches Merkmal höherer Wirbeltiere – Säugetiere, Vögel und Reptilien.

Bei eierlegenden Vögeln und Reptilien entwickelt sich die Allantois um den Embryo entlang der Schalenwände. In seiner äußeren Schicht, dem sogenannten Mesoderm, bildet es ein ausgedehntes Netzwerk von Blutgefäßen, mit denen es interagiert Außenumgebung. Bei Säugetieren ist die Allantois Teil der Nabelschnur.

Es gibt mehrere Möglichkeiten, einen sich entwickelnden Hühnerembryo zu infizieren: auf der Chorioallantoismembran, in den Allantois- und Amnionhöhlen, im Dottersack und im Körper des Embryos.

Die Infektion der Chorioallantoismembran dient der Isolierung und Kultivierung von Viren, die Plaques auf den Membranen bilden (Impfviren, Pocken, Herpes simplex). Vor der Infektion werden die Eier mit einem Ovoskop untersucht und die Grenze zwischen Luftraum und Chorioallantoismembran mit einem Bleistift umrissen. Die Oberfläche des Eies über dem Luftraum und an der Infektionsstelle wird mit Alkohol abgewischt, verbrannt, mit Jod behandelt und ein Loch in den Hohlraum des Luftsacks gebohrt.

An der Infektionsstelle wird die Schale entfernt, um die Unterschalenmembran nicht zu beschädigen, und dann mit einer kurzen sterilen Nadel durchstochen, um die Chorioallantoismembran nicht zu beschädigen. Die Luft aus dem Hohlraum des Luftsacks wird abgesaugt. Mit einer Tuberkulinspritze mit kurzer Nadel oder einer Pasteurpipette wird virales Material (0,05 - 0,2 ml) auf die Chorioallantoismembran aufgetragen. Das Loch in der Schale wird mit einem sterilen Deckglas oder dem gleichen ausgesägten Stück der Schale abgedeckt und die Ränder mit geschmolzenem Paraffin gefüllt. Infizierte Embryonen werden horizontal auf einen Ständer gelegt und in einem Thermostat inkubiert. Die Embryonen werden frühestens nach 48 Stunden Inkubation präpariert. Auf der infizierten Schale finden sich weißliche, undurchsichtige Flecken verschiedene Formen(Plaketten).

Infektion in der Allantoishöhle. Das in die Allantois eingeführte Virus vermehrt sich in den endodermalen Zellen und gelangt dann in die Allantoisflüssigkeit. Die Infektion erfolgt auf folgende Weise: Mit der Spitze eines Skalpells oder einer Schere wird ein Einstich in die Hülle über der Luftkammer vorgenommen, wonach eine Nadel mit einer Spritze in vertikaler Richtung durch das Loch eingeführt wird, die durch die Luftkammer verläuft Die Chorioallantoismembran dringt in die Allantoishöhle ein, das Material wird in einem Volumen von 0,1 ml injiziert und das Loch mit Paraffin gefüllt.

Infektion im Dottersack. Hierzu werden 5 bis 10 Tage alte Embryonen verwendet. Am häufigsten sind zwei Infektionsmethoden. Beim ersten Verfahren wird das Material durch den Luftraum eingebracht. In der Mitte des Eies wird ein Loch gemacht, das Ei wird mit dem stumpfen Ende nach rechts auf einen Ständer gestellt und eine an einer Spritze befestigte Nadel wird in vertikaler Richtung durch das Loch eingeführt. Die Nadel dringt durch die Chorioallantoismembran. die Allantoishöhle in das Eigelb. In den Dottersack können 0,1 bis 0,5 ml virushaltiges Material injiziert werden. Nach der Infektion wird das Loch in der Schale mit Paraffin gefüllt und der Embryo in einen Thermostat gelegt. Bei der zweiten Methode wird an der Grenze des Luftraums auf der Seite, auf der das Eigelb liegt (der dem Embryo gegenüberliegenden Seite), ein Einstich in die Schale vorgenommen, durch den infektiöses Material eingeführt wird. Die Richtung der Nadel sollte zur Mitte des Eies zeigen.

Ein mit Virusmaterial infizierter Hühnerembryo wird je nach Art des eingeschleppten Virus für 2-3 Tage in einen Inkubator gelegt. Für die Entwicklung von Viren aus Proben, die einem Patienten entnommen wurden (z. B. Nasen-Rachen-Abstriche zur Diagnose einer Grippe), bietet der Hühnerembryo ein gutes Umfeld. Anhand der Art der Veränderungen, beispielsweise im Gewebe der Chorioallantoismembran, können wir direkt feststellen, um welche Art von Virus es sich handelt. Pocken- und Herpesviren rufen sehr charakteristische Veränderungen hervor. Einige Viren vermehren sich sehr intensiv in verschiedenen Geweben des Hühnerembryos und liefern das Ausgangsmaterial für die Herstellung viraler Antigene, die für die Labordiagnose von Viruserkrankungen notwendig sind. In Hühnerembryonen vermehrte Viren dienten als Ausgangsmaterial zur Herstellung von 18 Arten von Impfimpfstoffen.

Trotz positive Seiten Trotz der in modernen virologischen Laboratorien so weit verbreiteten Zellkulturen hat der Hühnerembryo in vielen Fällen seinen Vorrang behalten und dient weiterhin klassisches Material für die Arbeit. Anzeichen für das Virus in einem Hühnerembryo sind das Absterben des Embryos, eine positive Hämagglutinationsreaktion auf Glas mit Allantois- oder Fruchtwasser, die Bildung fokaler Läsionen („Plaques“) auf der Chorion-Allantois-Membran sowie im RHA.

Guten Tag, liebe Leser! Heute geben wir eine Beschreibung, zeigen Fotos und Videos über die Entwicklung eines Huhns im Ei Tag für Tag während der Brutzeit zu Hause und in Geflügelfarmen. Es wird sowohl im Fabrikmaßstab als auch auf privaten Bauernhöfen souverän praktiziert.

Aber trotz seiner weit verbreiteten Verwendung denken nur wenige Menschen über den komplexen Mechanismus auf genetischer Ebene nach, der das Wachstum und die Entwicklung des Huhns gewährleistet.

Es gibt immer noch die Meinung, dass das Küken aus dem Eigelb wächst. In diesem Artikel erfahren Sie, welche Geheimnisse sich darunter verbergen und welche „schreckliche“ Bedeutung sich hinter den Wörtern „Allantois“ bei einem Huhn und „Amnion“ bei einem Huhn verbirgt und welche Funktion sie erfüllen.

Entwicklung eines Huhns im Ei bei Tagesfoto

Blastodisc

Die Entwicklung des Kükens beginnt mit der Blastodisc. Blasodisk ist ein kleines Zytoplasma-Gerinnsel, das sich auf der Oberfläche des Eigelbs befindet. An der Stelle der Blastodenscheibe ist die Dichte des Dotters viel geringer, was dazu beiträgt, dass der Dotter ständig mit der Blastodenscheibe nach oben schwimmt.

Diese Funktion sorgt für eine bessere Erwärmung während des Inkubationsprozesses. Die befruchtete Blastodermscheibe beginnt bereits im Körper des Huhns mit der Teilung und ist zum Zeitpunkt der Ablage bereits vollständig von Blastoderm umgeben. Die Blastodisk sieht aus wie ein kleiner weißer Fleck von etwa 2 mm Größe.

Der helle Halo, der die Keimscheibe ringförmig umgibt, ist das Blastoderm.

Wenn das Ei günstige Umweltbedingungen erreicht und nach dem Legen aufhört, wird die Zellteilung fortgesetzt.

Du solltest wissen: Entgegen der landläufigen Meinung, dass eine Ovoskopie erst ab dem 6. Tag der Inkubation durchgeführt werden kann, ist die Entwicklung des Blastoderms 18–24 Stunden nach Beginn der Inkubation deutlich sichtbar. An dieser Stelle ist deutlich eine Verdunkelung mit einem Durchmesser von 5–6 mm zu erkennen, die sich beim Umdrehen des Eies leicht verschiebt.

An den Tagen 2–3 der Inkubation beginnt die Entwicklung provisorischer Membranen:

1. Amnion in einem Huhn
2. Allantois in einem Huhn

Bei allen handelt es sich in der Tat um temporäre Organe, deren Aufgabe es ist, die lebenswichtige Aktivität des Embryos bis zu seiner endgültigen Bildung sicherzustellen.

Amnion in einem Huhn

Es handelt sich um eine Hülle, die den Embryo dank ihrer Flüssigkeitsfüllung vor physischer Einwirkung und Austrocknung schützt. Das Amnion des Kükens reguliert die Flüssigkeitsmenge je nach Alter des Embryos.

Die Epitheloberfläche der Fruchtblase ist in der Lage, die Höhle des Embryos mit Wasser zu füllen und sorgt außerdem für den Abfluss von Flüssigkeit während des Wachstums.

Allantois in einem Huhn

Eines der temporären Organe, das viele Funktionen erfüllt:

• Versorgung des Embryos mit Sauerstoff;
• isoliert Abfallprodukte aus dem Embryo;
• beteiligt sich am Flüssigkeitstransport und Nährstoffe;
• führt die Abgabe von Mineralien und Kalzium von der Schale an den Embryo durch.

Die Allantois des Kükens bilden während des Wachstumsprozesses ein verzweigtes Gefäßnetzwerk, das die gesamte Innenfläche des Eies auskleidet und über die Nabelschnur mit dem Küken verbunden ist.

Huhn atmet ein Ei ein

Der Sauerstoffaustausch im Ei erfolgt je nach Entwicklungsstadium des Huhns nach einem unterschiedlichen Mechanismus. Im Anfangsstadium der Entwicklung gelangt Sauerstoff vom Eigelb direkt zu den Blastodermzellen.

Mit dem Aufkommen des Kreislaufsystems gelangt Sauerstoff aus dem Eigelb in das Blut. Aber das Eigelb kann die Atmung eines schnell wachsenden Organismus nicht vollständig gewährleisten.

Ab dem 6. Tag wird die Funktion der Sauerstoffversorgung nach und nach auf die Allantois übertragen. Sein Wachstum beginnt in Richtung der Luftkammer des Eies und bedeckt dort einen immer größeren Innenbereich der Schale. Je größer das Küken wird, desto größer ist die Fläche, die die Allantois bedeckt.

Im ovoskopischen Zustand sieht es aus wie ein rosafarbenes Netzwerk, das das gesamte Ei bedeckt und sich an der scharfen Seite schließt.

Hühnerernährung im Ei

In den ersten Tagen der Entwicklung nutzt der Embryo die Nährstoffe Eiweiß und Eigelb. Da das Eigelb einen ganzen Komplex an Mineralien, Fetten und Kohlenhydraten enthält, kann es alle Grundbedürfnisse eines wachsenden Körpers decken.

Nach der Schließung der Allantois (Tag 11 der Entwicklung) kommt es zu einer Umverteilung der Funktionen. Der Embryo wird größer und nimmt eine Position entlang der Längsachse des Eies ein, wobei sein Kopf zum stumpfen Ende zeigt. Das Protein konzentriert sich zu diesem Zeitpunkt im scharfen Ende des Eies.

Das Gewicht des Kükens sorgt in Verbindung mit dem Druck der Allantois für die Verdrängung des Proteins und sein Eindringen durch das Amnion in den Mund des Embryos. Dieser kontinuierliche Prozess gewährleistet das schnelle Wachstum und die Entwicklung des Kükens im Ei Tag für Tag während der Brutzeit.

Ab 13 Tagen Mineralien wofür das Huhn verwendet wird weitere Entwicklung, werden von den Allantois aus der Schale abgegeben.

Sie sollten wissen: Eine normale Hühnerernährung kann nur durch eine rechtzeitig geschlossene Allantois beim Huhn gewährleistet werden. Wenn das scharfe Ende des Eies im geschlossenen Zustand noch Eiweiß enthält, das nicht mit Gefäßen bedeckt ist, fehlen dem Huhn die Nährstoffe für das weitere Wachstum.

Eierposition und Kükenentwicklung

IN In letzter Zeit Inkubation wird zunehmend praktiziert Hühnereier in vertikaler Position. Diese Methode hat jedoch nicht den besten Einfluss auf die Entwicklung des Huhns.

In vertikaler Position beträgt die maximale Neigung beim Drehen 45°. Diese Neigung reicht für ein normales Wachstum der Allantois und deren rechtzeitige Schließung nicht aus. Dies gilt insbesondere für große Eier.

Bei der Inkubation in horizontaler Position erfolgt eine Drehung um 180°, was sich positiv auf das Wachstum der Allantois und damit auf die Ernährung des Kükens auswirkt.

In der Regel wiegen Flauschige, die mit vertikal gelegten Eiern geschlüpft sind, 10 % weniger als solche, die mit horizontal gelegten Eiern geschlüpft sind.

Die Bedeutung des Eierdrehens für die Entwicklung von Küken

Das Wenden der Eier während der Brutzeit ist in allen Entwicklungsstadien erforderlich, mit Ausnahme des ersten und der letzten beiden Tage. Am ersten Tag ist eine intensive Erhitzung der Blastodisc nötig und am letzten Tag hat das kleine Quietschen bereits die Position zum Durchbrechen der Schale eingenommen.

An Anfangsstadien Durch das Wenden der Eier wird die Gefahr des Anhaftens von Blastoderm oder Amnion vermieden innen Muscheln.

Rotation hilft auch:

• Reduzierung des Amnions;
• gleichmäßige Erwärmung der Eier;
• Übernahme der richtigen Position durch den Embryo;
• Verbesserung des Gasaustausches;
• rechtzeitige Schließung der Allantois;
• Verbesserung der Ernährung des Fötus.

Nachdem wir den Artikel gelesen haben, können wir nun die Komplexität der Prozesse beurteilen, die bei einem kleinen Hahn oder einer kleinen Henne während ihrer Entwicklung von mehreren Zellen zu einem kleinen Vogel ablaufen. Dieser Prozess ist nicht weniger komplex als die Entwicklung eines Menschenkindes oder beispielsweise eines Kätzchens im Mutterleib, wo konstante Bedingungen gewährleistet sind.

Die Entwicklung eines Kükens im Ei am Tag hängt vollständig von den äußeren Bedingungen ab, deren Bereitstellung die Inkubation ist.

Wir wünschen allen ein erfolgreiches Schlüpfen von Gelb-, Grau- und anderen Flauschtieren!

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Hier ist ein Foto unserer regelmäßigen Leserin Yulia Arepteva, das Huhn ist darunter geschlüpft!

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Die Einführung von Methoden zur Kultivierung von Viren in Hühnerembryonen war für die Entwicklung der Virologie von großer Bedeutung. Zur Virusvermehrung werden Hühnerembryonen im Alter von 7–12 Tagen verwendet, die in einem Thermostat bei 37 °C inkubiert werden. Eine notwendige Bedingung Für die korrekte Entwicklung des Embryos ist es notwendig, eine bestimmte Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten, die durch das Stellen eines Gefäßes mit Wasser in einen Thermostat erzeugt werden kann. Die Kultivierung von Viren in Hühnerembryonen erfolgt an verschiedenen Stellen des infizierten Embryos:

1) auf der Chorion-Allantois-Membran;

2) in die Allantoishöhle;

3) in die Fruchthöhle;

4) in den Dottersack.

Die Infektion von Hühnerembryonen erfolgt in einer Box mit sterilen Instrumenten. Vor einer Infektion werden Hühnerembryonen zweimal mit einem mit Alkohol befeuchteten Wattestäbchen abgewischt.

Infektion der Chorion-Allantois-Membran. Schneiden Sie nach der Desinfektion des Eies vorsichtig ein Stück der Schale vom stumpfen Ende ab und entfernen Sie die Unterschalenmembran – so kommt die Chorion-Allatio-Membran zum Vorschein. Infektiöses Material in einer Menge von 0,1–0,2 ml wird mit einer Spritze oder Pasteurpipette auf die Chorion-Allantois-Membran aufgetragen. Nach der Infektion wird das Loch mit einer Kappe verschlossen und der Spalt zwischen ihm und dem Hühnerembryo mit Paraffin gefüllt. Schreiben Sie auf die andere Seite des Eies mit einem einfachen Bleistift den Namen des infektiösen Materials und das Datum der Infektion.

Infektion in der Fruchthöhle. Das Ei ist ovoskopisch und es wird ein Bereich auf der lateralen Seite ausgewählt, in dem die Chorion-Allantois keine großen Blutgefäße aufweist. Dieser Bereich wird mit einem Bleistift markiert. Die Eier werden horizontal auf einen Ständer gestellt, desinfiziert und mit einem speziellen sterilen Speer ein Loch gestochen. Und Schale bis zu einer Tiefe von 2-3 mm, durch die eine Nadel mit infektiösem Material im gleichen Abstand direkt in die Fruchthöhle eingeführt wird. Um ein Zurückfließen der injizierten Flüssigkeit zu verhindern, wird zunächst oberhalb des Luftsacks ein Einstich vorgenommen. Anschließend werden beide Löcher mit Paraffin gefüllt.

Infektion in der Allantoishöhle. Die Ansteckung erfolgt ebenfalls in einer schattierten Box. Der Luftraum wird markiert, die Hülle über dem Luftraum desinfiziert und eine Spritzennadel mit Material durch ein Loch in der Hülle in Richtung Embryo eingeführt. Wenn die Nadel in die Allantoishöhle eindringt, wird eine Verschiebung des Embryoschattens beobachtet. Nach der Infektion wird das Loch mit Paraffin gefüllt.

Infektion im Dottersack. Die Schale wird desinfiziert. Das Ei wird mit der stumpfen Seite nach rechts auf den Ständer gelegt, so dass der Dotterfleck nach oben zeigt. In der Mitte über der Luftkammer ist ein Loch gebohrt. Durch ein Loch in der Schale wird in horizontaler Richtung eine Spritzennadel bis zu einer Tiefe von 2-3 mm eingeführt, die in den Dottersack eindringt. Das Material wird in einem Volumen von 0,2–0,3 ml verabreicht. Nach dem Einbringen des Materials wird das Loch gewachst.

Temperatur und die Dauer der Inkubation hängt davon ab biologische Eigenschaften dieses Virus. Infizierte Eizellen werden täglich überprüft und eine Ovoskopie durchgeführt, um die Lebensfähigkeit des Embryos zu überprüfen. Wenn Embryonen am ersten Tag sterben, ist die Ursache meist ein Trauma während der Infektion. Solche Eier werden aus Erfahrung ausgebrütet. Das Vorhandensein des Virus in einem infizierten Embryo wird durch charakteristische Veränderungen in der Chorion-Allantois-Membran eines infizierten Hühnerembryos festgestellt. Viren, die keine hämagpotinierende Aktivität aufweisen, werden mittels RSC nachgewiesen. Um das Virus im Allantois- oder Fruchtwasser infizierter Embryonen nachzuweisen, wird eine RGA durchgeführt.

Isolierung und Kultivierung von Viren

Die Isolierung und Identifizierung des Erregers ist der „Goldstandard“ in der Diagnostik viraler Infektionen.

Zellkultur

Viren vermehren sich nur in lebenden Zellen und die Isolierung des Erregers in einer infizierten Zellkultur ist eine der wichtigsten Methoden zur Diagnose viraler Infektionen. Da sich die meisten pathogenen Viren durch Gewebe- und Typspezifität unterscheiden, ist es möglich, für fast jedes Virus geeignete Zell- oder Gewebekulturen auszuwählen und Standardkultivierungsbedingungen (das Vorhandensein von Zellen desselben Typs) zu schaffen. Die Vermehrung des Virus wird durch empfindliche (permissive) Zellen sichergestellt. Wenn daher ein unbekannter Erreger isoliert wird, werden 3-4 Zellkulturen gleichzeitig infiziert, wobei davon ausgegangen wird, dass eine davon möglicherweise permissiv ist. Zellkulturen werden durch Dispergierung der entsprechenden Organe und Gewebe gewonnen, häufiger werden jedoch embryonale Gewebe (menschlich und tierisch) oder transformierte Tumorzellen verwendet. Wenn Zellkulturen auf einer geeigneten flachen Oberfläche platziert werden, wachsen sie typischerweise als Monoschicht.

Primäre trypsinisierte Kulturen. Zellsuspensionen werden durch Homogenisierung der entsprechenden, mit Trypsin vorbehandelten Gewebe gewonnen. Kulturen bestehen oft aus gemischten Zelltypen und können nicht rekultiviert werden. Die Lebensfähigkeit solcher Pflanzen beträgt 2-3 Wochen.

Halbkontinuierliche Zelllinien dargestellt durch diploide Zellen von Menschen und Tieren. Kulturen eignen sich nur begrenzt für erneute Ausbreitung und Wachstum (in der Regel nicht mehr als 20–30 erneute Aussaaten), behalten aber ihre Lebensfähigkeit bei und unterliegen keiner spontanen Transformation.

Kontinuierliche Zelllinien(heteroploide Kulturen) werden durch Zellen repräsentiert, die einer Langzeitkultivierung und spontanen Transformationen unterzogen wurden. Kulturen sind zur wiederholten Ausbreitung und Transplantation fähig. Die Arbeit mit ihnen ist im Vergleich zur Vorbereitung von Primärkulturen weniger arbeitsintensiv. Die transplantierten Zellen sind in ihrer Morphologie relativ identisch und in ihren Eigenschaften stabil.

Organkulturen

Nicht alle Zelltypen sind in der Lage, als Monoschicht zu wachsen; in manchen Fällen ist die Aufrechterhaltung differenzierter Zellen nur in Organkulturen möglich. Es handelt sich in der Regel um eine Gewebesuspension mit einer speziellen Funktion, die auch als „Gewebe“ bezeichnet wird Kultur des Erlebens von Gewebe.

Hühnerembryonen (Abb. 1-20) - praktisch ideale Modelle zur Kultivierung bestimmter Viren (zum Beispiel Influenza und Masern). Der geschlossene Hohlraum des Embryos verhindert das Eindringen von Mikroorganismen von außen sowie die Entstehung spontaner Virusinfektionen. Embryonen werden zur primären Isolierung von Viren aus pathologischem Material verwendet; zum Passivieren und Konservieren sowie zum Gewinnen benötigte Mengen Virus. Einige Erreger (z. B. Herpesviren) verursachen charakteristische Veränderungen (daran lässt sich die Erkrankung erkennen). Die Infektion erfolgt an der Chorion-Allantois-Membran, in der Amnion- oder Allantoishöhle oder im Dottersack.

Infektion der Chorion-Allantois-Membran. Normalerweise werden 10-12 Tage alte Embryonen verwendet. Die Eier werden im Durchlicht betrachtet, die Lage des Luftsacks wird notiert und ein Bereich ohne Blutgefäße ausgewählt. Entfernen Sie vorsichtig das Schalenfragment, lösen Sie die äußere Schale und ziehen Sie diese mit leichtem Druck ab. Dann wird am Rand des Luftsacks ein Loch gemacht. Beim Absaugen durch dieses Loch wird die Chorion-Allantois-Membran von der Außenmembran abgeschält. Darauf wird das bakterien- und protozoenfreie Testmaterial aufgetragen (durch Bakterienfilter geleitet und mit Bakteriziden behandelt).

Infektion in der Fruchthöhle. Typischerweise werden 7-14 Tage alte Embryonen verwendet, bei denen nach Ablösung der Chorion-Allantois-Membran (siehe oben) die Öffnung erweitert, die Amnionmembran mit einer Pinzette gegriffen und durch die Chorion-Allantois-Membran entfernt wird. Dadurch wird das Testmaterial in die Fruchthöhle eingeführt.

Infektion in der Allantoishöhle. 10 Tage alte Embryonen werden durch Löcher in der Schale und den darunter liegenden Membranen infiziert (siehe oben).

Infektion im Dottersack. Es werden 3–8 Tage alte Embryonen verwendet, bei denen der Dottersack in diesem Alter fast die gesamte Eihöhle einnimmt. Die Infektion erfolgt durch ein Loch im Luftsack

Beobachtung und Aufzeichnung der Ergebnisse. Als virushaltiges Material können Sie den Inhalt des Dottersacks, Allantois- und Fruchtwasser oder den gesamten Embryo, zusammen mit der Umgebung, verwenden

Stoffe in Stücke. Zur Identifizierung von Abb. 1-20.Schematische Darstellung

charakteristische Läsionen am Chorion des sich entwickelnden Hühnerembryos.

Die Schale wird von der Allantoismembran entfernt

und die Außenhülle. Anschließend wird die Membran entfernt und in steriles Wasser gelegt. Die Art der Läsionen wird vor einem dunklen Hintergrund untersucht.

Tiermodelle

Wenn es nicht möglich ist, das Virus mit Standardmethoden zu isolieren und zu identifizieren in vitro Tieren, die gegenüber dem Erreger empfindlich sind, wird infektiöses Material verabreicht und nach der Entwicklung eines typischen Infektionsprozesses werden empfindliche Zellkulturen erneut infiziert. Am häufigsten werden Mäuse, Kaninchen und Affen verwendet; Um einige Viren (z. B. Coxsackie-Viren) zu isolieren, werden säugende Mäuse infiziert. Aufgrund der hohen Kosten und Komplexität der Labortierhaltung wurden diese fast überall durch Zellkulturen ersetzt. Dennoch werden Tiermodelle aktiv eingesetzt, um die Merkmale der Pathogenese und die Bildung von Immunantworten bei Virusinfektionen zu untersuchen.

Seitdem entdeckt wurde, dass sich Influenzaviren in Hühnerembryonen vermehren, hat sich diese Methode in der Virologie durchgesetzt, da sie einfach anzuwenden und nicht teuer ist.

Es werden 7–9 Tage alte Hühnerembryonen verwendet (der gesamte Entwicklungszyklus beträgt 21 Tage).

Vor der Infektion wird die Oberfläche mit Alkohol und Jodlösung behandelt, ein Loch in die Schale gebohrt und mit einer sterilen Spritze infiziert.

Infektionswege: in die Fruchthöhle, in die Allantoishöhle oder in den Dottersack. Viren vermehren sich auf den entsprechenden Membranen und reichern sich in der Hohlraumflüssigkeit an, die dann für weitere Forschungen gesammelt werden kann.

Embryonen werden bei 37 Grad kultiviert. 3 Tage, dann wird die Schale erneut bearbeitet, der Embryo mit sterilen Instrumenten geöffnet und die virushaltige Flüssigkeit gesammelt. Alle Arbeiten zur Infektion und Öffnung werden in einer Box durchgeführt.

Kultivierung auf Zellkulturen.

In der Virologie werden in den letzten Jahrzehnten Zellkulturen eingesetzt, die die Kultivierung und Untersuchung eines viel größeren Spektrums an Viren ermöglichen, da nicht alle menschlichen Viren in Tieren oder Embryonen isoliert werden können. Daher nutzt die moderne Virologie Zellkulturen, von denen mittlerweile eine große Zahl gewonnen wurde.

Arten von Zellkulturen

a) primär - wird aus embryonalem Gewebe gewonnen, indem es zerkleinert, mit Trypsin behandelt wird, um Zellen aufzulösen (zu trennen) und weiter kultiviert wird

in vitro in einer speziellen Kulturflüssigkeit.

b) miteinander verflochten– Sie werden aus Tumorgewebe gewonnen und zeichnen sich dadurch aus, dass sie unbegrenzt kultiviert werden können, wobei lediglich das Kulturmedium und die Schalen gewechselt werden müssen.

Während des Kultivierungsprozesses entsteht eine Monoschicht auf Glas : das heißt, eine Zellschicht.

Nun können Sie diese Zellen mit dem Testmaterial mit dem mutmaßlichen Virus oder mit vorhandenen Viren infizieren. Schalen mit infizierten und nicht infizierten Zellen werden in einem Thermostat bei 37 Grad kultiviert.

Der Prozess der Anreicherung von Virionen in Zellkulturen dauert etwa 48–72 Stunden.

Durch die Auswahl geeigneter Kulturen können nahezu alle menschlichen Viren kultiviert werden.

Der nächste Studienschritt ist die Indikation und Identifizierung von Viren.

Anzeigemethoden.

Indikation - Hierbei handelt es sich um den Nachweis von Viren direkt im Testmaterial oder in der Kulturflüssigkeit oder in infizierten Zellen.

I. Liegen Virionen in Flüssigkeit vor, können sie mithilfe der Hämagglutinationsreaktion nachgewiesen werden.

Die Essenz der Reaktion: Einige Arten von Viren sind in der Lage, alle roten Blutkörperchen spontan zusammenzukleben (d. h. Hämagglutination zu verursachen). Beispielsweise verkleben Influenza-Virionen in Erythrozyten von Hühnern, einige Adenoviren verkleben in Erythrozyten von Ratten usw.

So können mit einer Suspension von Erythrozyten in physiologischer Lösung Viren in virushaltiger Flüssigkeit nachgewiesen werden.

II. Wenn sich Viren in der Zellkultur vermehren, aber hämagglutinieren, dann können sie mithilfe der Hämadsorptionsreaktion nachgewiesen werden: Eine Suspension roter Blutkörperchen wird auf die Kultur aufgetragen, inkubiert, abgelassen – ist die Kultur infiziert, bleiben die roten Blutkörperchen hängen direkt zu den infizierten Zellen - das lässt sich unter dem Lichtmikroskop erkennen.

III.Andere Wirkungen:

a) Viren verursachen eine Zerstörung der Monoschicht – dies wird als zytopathogene Wirkung des Virus bezeichnet – CPE.

b) Viren verursachen morphologische Veränderungen in Zellen: intrazelluläre oder intranukleäre Einschlüsse, Bildung von Synzytium, Symplasten (d. h. die Verschmelzung mehrerer Zellen zu einer Formation aufgrund von Schäden an Zellmembranen).