Metode de infectare a unui embrion de pui cu un virus. embrioni de pui

Scopul lecției

Pentru a familiariza elevii cu metodele de selectare a embrionilor de pui pentru cultivarea virusurilor.

Echipamente și materiale

Embrioni de pui 9-12 zile de vârstă de incubație, ovoscop, tampoane cu alcool, suporturi pentru embrioni, pensete, foarfece, gips adeziv, ace, seringi, creioane, perforatoare, ace, tabele, diagrame, echipament multimedia, prezentări MS Office power point pe tema lecției.

Metodologia lecției și instrucțiuni pe această temă

Explicația profesorului

Cultivarea virusurilor pe embrioni de pui este cea mai accesibilă și convenabilă metodă pentru izolarea primară a virusului. Practica utilizării acestei metode de infecție a arătat o serie de avantaje față de alte metode. Pentru infecție se folosesc embrioni de 5-12 zile de incubație.

AVANTAJE ȘI DEZAVANTAJE ALE embrionilor de pui ca OBIECTE BIOLOGICE

Cultivarea virusurilor în embrionii de pui este cea mai accesibilă și convenabilă metodă atât pentru izolarea primară a virușilor de la animalele bolnave, cât și de la obiecte. Mediul extern, și pentru cultivarea ulterioară a virusurilor în laborator. Această metodă este utilizată pe scară largă pentru identificarea virusurilor și anticorpilor, precum și pentru prepararea vaccinurilor și diagnosticelor. Practica aplicării a arătat o serie de avantaje ale acestei metode față de cultivarea virusurilor pe animale de laborator. Se știe că șoarecii albi, care sunt utilizați pe scară largă în studiile virologice, pot fi infectați spontan cu o serie de infecții virale: ectromelie, coriomeningită limfocitară, encefalită Taylor, pneumonie virală, virusul Sendai și altele, ceea ce complică foarte mult munca și duce adesea. la concluzii eronate la evaluarea rezultatelor obţinute. Cultivarea virusurilor pe embrioni de pui elimină în mare măsură dificultățile de mai sus. Pe lângă aceasta, din embrion de pui se poate obţine mult mai mult virus decât de la animalele de laborator. Embrionul de pui are o viabilitate și rezistență mai mare la diferite tipuri de influențe care sunt inevitabile atunci când este introdus materialul de testat. Cu o pricepere cunoscută în lucrul cu embrioni și respectarea regulilor de asepsie, moartea lor este neglijabilă. Cea mai mare risipă de embrioni apare atunci când materialul este introdus în cavitatea amniotică și în sacul vitelin, dar nici în aceste cazuri nu depășește 10–15% dacă sunt îndeplinite condițiile de incubație necesare.

Embrionii de pui ca sistem viu au intrat în practica virologică în anii 1930. Utilizarea lor a extins gama de virusuri cultivate în laborator, a făcut posibilă rezolvarea cu mai mult succes a problemelor cu care se confruntă virusologia datorită faptului că embrionii de pui au o serie de avantaje față de animalele de laborator: 1) membrana cochiliei și cochiliei protejează în mod fiabil embrion din infecția bacteriană din mediul extern; 2) un avantaj important al embrionilor este și sensibilitatea lor ridicată la o gamă largă de viruși, ceea ce se explică prin dezvoltarea insuficientă a mecanismelor de protecție; 3) embrionii de pui sunt un obiect ușor accesibil datorită dezvoltării unei rețele largi de ferme și incubatoare de păsări; 4) embrionii de pui sunt economici, nu necesită îngrijire și hrănire.

Principalele dezavantaje sunt: ​​1) incapacitatea de a garanta pe deplin sterilitatea acestui sistem viu, deoarece embrionii pot transporta viruși și alți agenți patogeni (virusuri de bronșită infecțioasă a găinilor, boala Newcastle, gripă, leucemie, chlamydia și micoplasmă) în conținutul lor. . Prezența lor poate distorsiona rezultatele studiului; 2) embrionii de pui nu sunt sensibili la toți virusurile.

SCOPUL UTILIZĂRII embrionilor de pui

Embrionii de pui sunt utilizați în virologie în principal în aceleași scopuri ca și animalele de laborator, și anume:

– detectarea unui virus activ în materialul patologic printr-un biotest;

- izolarea primară a virusului. Virușii care provoacă boli la păsări, precum și unii virusuri de mamifere, sunt izolați și cultivați efectiv pe embrioni de pui;

– menținerea virușilor în laborator;

– titrarea virusului;

- acumularea virusului pentru cercetări de laborator și vaccinuri;

– ca obiect de testare în reacția de neutralizare.

CERINȚE PENTRU embrionii de pui

Ouăle trebuie obținute din siguranță boli virale ferme. În ouăle fecundate, chiar și de la pui sănătoși clinic, se pot întâlni diverse virusuri întâlnite la aceste păsări: boala Newcastle, bronșita infecțioasă, laringotraheita infecțioasă, encefalomielita, parainfluenza-2, poliartrita, variola, arbovirusurile, adenovirusurile etc. Prezența acestor virusuri. poate, pe de o parte, să conducă la erori de diagnostic, iar pe de altă parte, pe baza fenomenului de interferență, să suprime reproducerea virusului în proba de testat. Embrionii lipsiți de virusuri de la găini infectate asimptomatic cu anumite virusuri pot fi, de asemenea, mai puțin sensibili sau complet insensibili la acțiunea acestui virus datorită prezenței anticorpilor specifici derivați de la mama cu gălbenuș. Pentru izolarea cu succes a virusului, este necesar ca puii ai căror embrioni sunt utilizați în muncă să nu fie vaccinați împotriva bolii, al cărei agent cauzal este căutat. Coaja de ou trebuie sa fie nepigmentata, curata (nu poate fi spalata). Vârsta embrionului trebuie să fie adecvată pentru metoda de infectare aleasă.

Pentru a asigura dezvoltarea normală a embrionilor în ouăle fecundate în perioada de incubație, este necesar să se mențină o anumită temperatură și umiditate. Embrionii în curs de dezvoltare tolerează căldura mult mai rău decât frigul. Prin urmare, o defecțiune pe termen scurt (în câteva ore) a sistemului de încălzire nu dăunează prea mult. Pentru pauze mai lungi este necesară încălzirea.

Ouăle pentru incubație au nevoie de acces gratuit aer proaspat care intră prin orificii de aerisire. Ele trebuie să fie întotdeauna deschise. Un ou, după cum se crede în mod obișnuit, consumă 1 litru de oxigen pe zi, ceea ce nu este surprinzător dacă ne amintim de dezvoltarea rapidă a embrionului pe parcursul a 21 de zile de incubație. De aceea ouăle nu trebuie să fie așezate aproape unele de altele, precum și una peste alta. Termostatele convenționale nu sunt potrivite pentru incubarea ouălor. Doar in caz de urgenta pot fi folosite in aceste scopuri, dar in acelasi timp deseori aerisiti si puneti un vas cu apa in interior pentru a asigura umiditatea necesara.

După 3-5 zile, ouăle depuse pentru incubare sunt iluminate folosind o masă specială sau o lampă manuală (dacă ouăle nu sunt scoase din tava incubatorului) pentru a le selecta pe cele nefertilizate. Ouăle de Leghorn sunt cele mai convenabile pentru munca virologică, deoarece coaja lor albă subțire vă permite să vedeți mai bine conținutul. Ouăle nefertilizate sau care conțin embrioni morți sunt îndepărtate din incubator. Proporția de ouă fertilizate variază semnificativ în funcție de mulți factori, inclusiv de perioada anului: primăvara este cea mai mare, iarna este cea mai scăzută.

A doua oară, embrionii sunt translucizi în ziua infecției planificate. Această perioadă depinde de tipul de virus, precum și de calea introducerii acestuia. Pe coajă, cu un creion obișnuit (nu cu cerneală), marcați locul infecției.

STRUCTURA embrionului de pui

De obicei, găina depune un ou fertilizat în care embrionul se află în stadiul de blastula sau gastrula timpurie. Când oul este încălzit la o temperatură apropiată de temperatura corpului puiului, dezvoltare ulterioară embrion (Fig. 15). În perioada de la a 5-a până la a 12-a zi de incubație, embrionii de pui pot fi utilizați pentru infectarea cu viruși.

Figura 15 - Secțiune schematică a unui embrion de pui în a 8-a zi de incubație: 1 - coajă; 2 - membrana cochiliei; 3 - membrana corioalantoidiană; 4 - cavitatea alantoidiană; 5 - sacul vitelin; 6 - proteine; 7 - camera de aer; 8 - corpul embrionului; 9 - cavitatea amniotică

Un ou cu un embrion de pui în curs de dezvoltare este acoperit la exterior cu o coajă tare poroasă, de care membrana coajă este strâns atașată. Acesta din urmă la capătul contondent al oului este împărțit în două foi, între care se formează o cameră de aer. Corpul embrionului se află excentric în ou, cu spatele mai aproape de coajă, capul este îndreptat spre camera de aer. Embrionul este scufundat în lichidul amniotic care umple cavitatea amniotică și este conectat la gălbenuș prin cordonul ombilical. Gălbenușul este, de asemenea, situat excentric și relativ la embrion, așa cum ar fi, pe cealaltă parte a axei longitudinale.

Direct sub membrana cochiliei există o cavitate alantoidiană care acoperă amniosul și sacul vitelin, iar în ziua a 10-11 se închide în capătul ascuțit al oului. În procesul de dezvoltare, membrana alantoidiană fuzionează cu corionul, formând o singură membrană corionallantoică (CAO). La capătul ascuțit al oului se află restul proteinei.

Infecția într-una sau alta parte a embrionului se realizează în perioada de dezvoltare maximă, când numărul de celule sensibile va fi cel mai mare.

În procesul de incubație, dimensiunile structurilor embrionare se modifică, ceea ce se datorează în mare parte lor scop functionalși determină vârsta optimă a embrionului pentru infectare.

Deci, sacul vitelin ca rezervor nutrienți are cel mai mare volum la începutul incubației, iar apoi (după a 12-a zi) pe măsură ce embrionul se dezvoltă, acesta scade. Infectează în sacul vitelin din a 5-a până în a 7-a zi de incubație.

Cavitatea amniotică, fiind un mediu tampon pentru dezvoltarea embrionului, o acoperă deja în a 5-a zi de incubație. Cantitatea medie de lichid la mijlocul perioadei de incubație este de aproximativ 1 ml.

Embrionii la vârsta de 6-10 zile sunt utilizați pentru infecția în cavitatea amniotică.

Cavitatea alantoică servește la colectarea produselor metabolice; în ea se acumulează săruri de acid uric, fosfor și compuși azotați. În procesul de creștere și dezvoltare a embrionului, lichidul alantoic devine acid. Cavitatea alantoică atinge dimensiunea maximă în a 9-12-a zi de dezvoltare a embrionului, prin urmare, infecția în cavitatea alantoică se efectuează în principal în a 9-11-a zi de incubație.

Membrana corioalantoică este bogată în vase de sânge, care, aderând strâns la suprafața interioară a învelișului poros, sunt saturate cu oxigen și furnizează corpul embrionului cu acesta, îndeplinind funcția organului respirator al embrionului. Dezvoltarea maximă a HAO ajunge în ziua 11-13. Infecția pe membrana corioalantoidiană se efectuează în a 10-12-a zi de incubație.

PREGĂTIREA embrionilor de pui pentru infecție

Embrionii sunt livrați din incubator fără a fi refrigerați pe drum. În laborator, embrionii sunt incubați într-un termostat la o temperatură de 37 °C și o umiditate de 60-70%, care se realizează prin fixarea vaselor deschise cu gura largă cu apă în termostat. Orificii de ventilație termostatul trebuie să fie deschis. Embrionii sunt plasați cu camera de aer sus în standuri speciale. Se recomandă să se permită embrionilor să se adapteze la noile condiții în timpul zilei și să își normalizeze funcțiile după stresul de transport până în momentul infecției. Dacă laboratorul are propriul incubator, atunci ouăle fertilizate depuse de găină sunt potrivite pentru depunerea în el timp de 10 zile.

Pregătirea embrionilor de pui pentru infecție include lumânarea și dezinfectarea cochiliei, precum și pregătirea adecvată a locului de muncă. Lumânarea este vizualizarea ouălor împotriva unei surse de lumină suficient de strălucitoare (ovoscop), în urma căreia se formează umbre din structurile interne pe partea neluminată a cochiliei (Fig. 16). Lumânarea se efectuează într-o cameră întunecată. În același timp, marginea camerei de aer, locația embrionului și zona zonei avasculare cu dimensiunea de 0,5x0,5 cm sunt marcate pe coajă cu un creion de grafit. Aceste semne servesc ca ghid atunci când alegerea locului de introducere a materialului care conţine virusuri. La lumânare, se determină, de asemenea, dacă embrionul este viu sau mort. Embrionii care prezintă mișcări active cu umplere bună cu sânge a vaselor CAO sunt considerați vii.

Figura 16 - Lumânarea unui embrion de pui în a 10-a zi de incubație. Umbrele sunt vizibile: 1 - embrion; 2- sacul vitelin; 3 - vasele de sânge ale CAO; 4 - camera de aer; 5 - proteine

Embrionii de pui sunt infectați în condiții aseptice (de preferință într-o cutie). În prebox, cochiliile embrionilor sunt tratate cu alcool iodat, apoi sunt șterse din nou în cutie și, uneori, sunt și flambate - sunt tratate cu o flacără a unui tampon umezit cu alcool.

Embrionii sunt fixați în suporturi speciale plasate într-o cuvă emailată pe o cârpă de tifon cu 3-4 straturi umezită cu o soluție dezinfectantă.

În lucrare se folosesc instrumente sterilizate prin fierbere. Se pun într-un borcan cu alcool și se ard cu o flacără de arzător înainte de fiecare reutilizare.

Demonstrație

a) semne clinice de boală la animalele de laborator infectate; b) metode de ucidere a animalelor de laborator; c) tehnici de autopsie (atrage atenția elevilor asupra statului organe interne) și tehnici de obținere a materialului care conține viruși; d) tehnici de realizare a amprentelor cerebrale; e) actiuni de decontaminare a locului de munca si a cadavrului dupa deschiderea animalului infectat.

Sarcini

1. Studiați structura embrionului de pui.

2. Efectuați o ovoscopie a unui embrion de pui, determinați viabilitatea acestuia și marcați limitele umbrelor formațiunilor naturale.

3. Pregătiți embrionii de pui pentru infecție.

Muncă independentă elevi

a) recunoașterea prin etichetă color a șoarecilor infectați de fiecare dintre elevi, analiza acestora stare clinică, ucidere, fixare într-o cuvă cu fund de ceară (parafină), deschidere; b) analiza modificărilor patoanatomice, obținerea de material care conține virus (organe parenchimatoase), pregătirea amprentelor cerebrale stratificate.

Elevii efectuează o ovoscopie a unui embrion de pui, determină viabilitatea acestuia și marchează limitele umbrelor formațiunilor naturale.

Rezumând lecția

Temă pentru următoarea lecție

Întrebări de control

1. Structura embrionului de pui.

2. De ce sunt folosiți embrionii de pui în virologie?

3. Care este structura unui embrion de pui în curs de dezvoltare?

Pentru studiile virologice se folosesc embrioni de pui cu vârsta de 7-12 zile ( cel mai adesea 9-12 zile, uneori 5-12 zile).

Înainte de infectare, determinați viabilitatea embrionului. La lumânare, embrionii vii sunt mobili, modelul vascular este clar vizibil. Cu un creion simplu, marcați limitele sacului de aer. Embrionii de pui sunt infectați în condiții aseptice, cu instrumente sterile, după ce au tratat în prealabil coaja de deasupra spațiului aerian cu iod sau alcool.

Metode de infectare a embrionilor de pui pot fi diferite: aplicarea virusului pe membrana corioalantoidiană, în cavitățile amniotice și alantoide, la sacul vitelin, corpul embrionului. Alegerea metodei de infectare depinde de proprietățile biologice ale virusului studiat.

Există două moduri de a infecta embrionii de pui:

1) deschis - învelișul de deasupra sacului de aer este tratat cu alcool și iod, învelișul este tăiat cu foarfece ascuțite, foaia superioară a învelișului de aer este îndepărtată și se efectuează infecția. Orificiul este închis cu un capac special din sticlă sau înveliș și etanșat cu parafină topită sterilă.

2) Închis - învelișul de deasupra sacului de aer este tratat cu alcool și iod, se face o gaură în carcasă cu un instrument de perforare și se injectează 0,1-0,2 ml de material care conține virusuri folosind o seringă cu un ac gros sub control. a unui ovoscop. Orificiul este închis cu parafină topită sterilă.

Embrionii infectați sunt incubați într-un termostat timp de 2-4 zile. Apoi sunt răcite la 4ºС pe tot parcursul zilei pentru o vasoconstricție maximă. Ele sunt deschise în condiții sterile, după ce a tratat în prealabil coaja cu alcool sau iod.

Indicarea virusului la embrionul de pui se face prin moartea embrionului, un test de hemaglutinare pozitiv pe sticla cu lichid alantoic sau amniotic, prin leziuni focale („placi”) pe membrana corion-alantoica.

Virușii pot fi cultivați numai în celule vii. Pentru a face acest lucru, utilizați orice sistem biologic: organisme animale, embrioni de pui, culturi celulare. La alegerea animalelor de laborator trebuie indeplinite urmatoarele cerinte: - animalele sa fie sanatoase. Cei nou admiși în vivarium sunt ținuți în carantină (șoareci și șobolani 14 zile, restul 21 de zile). Pentru a exclude infecțiile latente (ascunse) de etiologie virală.

Pentru toate animalele sunt îndeplinite următoarele cerințe: - animalele trebuie să fie sensibile la acest virus; - vârsta animalului mare importanță: tinerii și nou-născuții sunt cei mai sensibili, dar în unele cazuri, animalele adulte sunt folosite pentru a identifica semnele clinice vii ale bolii; - animalele trebuie să fie de aceeași vârstă și greutate corporală; animalele liniare sunt mai potrivite pentru aceasta, adică. obţinute ca urmare a consangvinizării.

În studiile virologice se utilizează infecția subcutanată, cutanată, intradermică, intramusculară, intraperitoneală, intravenoasă, orală, intranazală, intracerebrală a animalelor de laborator.

Izolarea și cultivarea virusurilor

Izolarea și identificarea agentului patogen este „standardul de aur” în diagnosticul infecțiilor virale.

Culturi celulare

Virușii se reproduc numai în celulele vii, iar izolarea agentului patogen într-o cultură de celule infectate este una dintre principalele metode de diagnosticare a infecțiilor virale. Deoarece majoritatea virusurilor patogeni sunt specifice țesutului și tipului, este posibil să se selecteze culturi de celule sau țesuturi adecvate pentru aproape fiecare virus, precum și să se creeze condiții standard de cultivare (prezența celulelor de același tip). Reproducerea virusului este asigurată de celule sensibile (permisive). Prin urmare, atunci când un agent patogen necunoscut este izolat, 3-4 culturi celulare sunt infectate simultan, presupunând că una dintre ele poate fi permisivă. Culturile celulare se obțin prin dispersarea organelor și țesuturilor corespunzătoare, dar mai des se folosesc țesuturi embrionare (umane și animale) sau celule tumorale transformate. Când sunt plasate pe o suprafață plană adecvată, culturile de celule cresc de obicei ca un monostrat.

Culturi primare tripsinizate. Suspensiile celulare sunt obținute prin omogenizarea țesuturilor adecvate pre-tratate cu tripsină. Culturile sunt adesea de tip mixt și nu pot fi re-cultivate. Viabilitatea unor astfel de culturi este de 2-3 săptămâni.

Linii celulare semi-permanente reprezentată de celule umane şi animale diploide. Culturile sunt adecvate în mod limitat pentru dispersie și creștere repetată (de regulă, nu mai mult de 20-30 de pasaje), menținând în același timp viabilitatea și nu suferă o transformare spontană.

Linii celulare continue(culturi heteroploide) sunt reprezentate de celule supuse cultivării pe termen lung și transformărilor spontane. Culturile sunt capabile de dispersie și replantare multiplă. Lucrul cu ele este mai puțin laborios în comparație cu pregătirea culturilor primare; celulele transplantate sunt relativ uniforme ca morfologie și stabile ca proprietăți.

Culturi de organe

Nu toate tipurile de celule sunt capabile să crească ca monostrat; în unele cazuri, menținerea celulelor diferențiate este posibilă numai în cultura de organe. Este de obicei o suspensie de țesut cu o funcție specializată, denumită și supraviețuirea culturii de țesuturi.

Embrioni de pui (Fig. 1-20) - practic modele ideale pentru cultivarea anumitor virusuri (de exemplu, gripa si rujeola). Cavitatea închisă a embrionului împiedică pătrunderea microorganismelor din exterior, precum și dezvoltarea infecțiilor virale spontane. Embrionii sunt utilizați pentru izolarea primară a virusurilor din material patologic; să le treacă și să le păstreze, precum și să primească cantitățile necesare virus. Unii agenți patogeni (de exemplu, herpesvirusurile) provoacă modificări caracteristice (pot fi utilizați pentru a recunoaște boala). Infectia se realizeaza pe membrana corion-alantoica, in cavitatea amniotica sau alantoica sau in sacul vitelin.

Infecție pe membrana corion-alantoidiană. De obicei se folosesc embrioni de 10-12 zile. Ouăle sunt văzute în lumină transmisă, se notează localizarea sacului aerian și se selectează o zonă fără vase. Îndepărtați cu grijă un fragment de coajă, eliberați învelișul exterior și îndepărtați-l cu o presiune ușoară. Apoi se face o gaură la marginea airbag-ului. Când se aspira prin acest orificiu, membrana corion-alantoică se exfoliază din învelișul exterior. Materialul de testat este aplicat pe acesta, fără bacterii și protozoare (trecut prin filtre bacteriene și tratat cu bactericide).

Infecție în cavitatea amniotică. De obicei, se folosesc embrioni de 7-14 zile, în care, după exfolierea membranei corion-alantoidiane (vezi mai sus), deschiderea este extinsă, membrana amniotică este capturată cu penseta și îndepărtată prin membrana corion-alantoidiană. Prin intermediul acestuia, materialul de testat este introdus în cavitatea amniotică.

Infecție în cavitatea alantoică. Embrionii de 10 zile sunt infectați prin găurile făcute în coajă și membranele de dedesubt (vezi mai sus).

Infecție în sacul vitelin. Se folosesc embrioni de 3-8 zile, la care la această vârstă sacul vitelin ocupă aproape toată cavitatea oului. Infecția se realizează printr-o gaură făcută în sacul de aer

Observarea si contabilizarea rezultatelor. Ca material care conține virusuri, puteți utiliza conținutul sacului vitelin, lichidele alantoic și amniotic sau întregul embrion, tăiat împreună cu mediul înconjurător.

bucăți de țesătură. Pentru a identifica fig. 1-20.Reprezentare schematică

leziuni caracteristice la un embrion de pui care dezvoltă corion.

membrana alantoidiană este îndepărtată din înveliș

și învelișul exterior. Membrana este apoi îndepărtată și pusă în apă sterilă. Natura leziunilor este studiată pe un fundal întunecat.

modele animale

Dacă este imposibil să izolați și să identificați virusul prin metode standard in vitro materialul infecțios este injectat în animalele susceptibile și, după dezvoltarea unui proces infecțios tipic, se realizează reinfectarea culturilor de celule sensibile. Cei mai des folosiți șoareci, iepuri și maimuțe; pentru a izola unii viruși (de exemplu, virusurile Coxsackie), șoarecii care alăptează sunt infectați. Datorită costului ridicat și complexității păstrării animalelor de laborator, culturile celulare le-au înlocuit aproape peste tot. Cu toate acestea, modelele animale sunt utilizate în mod activ pentru a studia caracteristicile patogenezei și formarea răspunsurilor imune în infecțiile virale.

Scopul lecției: pentru a familiariza elevii cu metodele de infectare a embrionilor de pui pentru cultivarea virusurilor.

Echipamente si materiale: embrioni de pui la vârsta de 9-12 zile de incubație, ovoscop, tampoane cu alcool, suporturi pentru embrioni, pensete, foarfece, ghips adeziv, ace, seringi, creioane, perforatoare, ace, tabele, diagrame, echipament multimedia, prezentări MS Office PowerPoint pe tema lecției.

Explicația profesorului.

Metoda de infectare afectează semnificativ reproducerea virusurilor în embrioni. Înainte de infectare, ouăle incubate sunt translucide, morții sunt separați. Pe coaja ouălor cu embrioni vii, care se disting prin culoarea roșie a vaselor de sânge și mișcarea embrionului, locul infecției este marcat cu un creion.

Embrionii sunt infectați într-o cutie sterilă cu o masă de lucru, două scaune, o alimentare cu gaz, instalații sanitare și un vid. Infecția în cavitatea amniotică se efectuează într-o cameră întunecată. La locul de muncă ar trebui să fie bine luminat. Înainte de muncă, masa este dezinfectată. Pentru a dezinfecta suprafața ouălor, pregătiți o soluție antiseptică (70% alcool, 2% soluție de iod) și un băț de lemn învelit în vată, o sondă dentară îndoită sau un burghiu pentru găurire. coaja de ou. Ouăle sunt infectate folosind o seringă de tuberculinizare sterilă și ace speciale. Locul infecției de pe ou este umplut cu parafină. Pentru a face acest lucru, se pregătesc bețișoare de parafină: se introduce o baghetă de sticlă într-o eprubetă umplută cu parafină topită, asigurându-se că se află în centrul eprubetei până când parafina se răcește.

Când este nevoie de un baston de parafină, pereții eprubetei sunt încălziți pe un arzător și parafina este scoasă din eprubetă de tija de sticlă. Ținând bețișorul peste flacără, topiți cantitatea de parafină necesară pentru a închide orificiul din ou. Această metodă este foarte curată și nu se produc vapori de parafină.

În plus, un pahar cu tampoane sterile de vată, un pahar cu soluție de hidroxid de sodiu 3% pentru uneltele uzate și un vas cu soluție de cloramină pentru obiectele din sticlă uzate sunt așezate pe birou în cutie. Dacă este necesar, puteți pregăti un suport pentru ouă, un bol mic emailat și medii de cultură sterile. Desktopul astfel pregătit este supus la iradiere UV timp de 1-2 ore.

Având în vedere patogenitatea virusurilor studiate, munca se desfășoară într-o mască, mănuși de cauciuc și ochelari de protecție.

Există șase metode de infectare a embrionilor. Cel mai adesea, infecția este utilizată în cavitatea alantoică și pe membrana corional-lantoică, mai rar - în cavitatea amniotică și în sacul vitelin și foarte rar - în corpul embrionului și în vasele de sânge ale CAO. Alegerea metodei este determinată de tropismul virusului, precum și de scopul infecției. Cu orice metodă de infecție, se injectează 0,1-0,2 ml de material infecțios.

Infecție în cavitatea alantoică.

Când sunt infectate prin această metodă, se înmulțesc bine virusurile gripale, boala Newcastle, rinoneumonia calului, stomatita veziculoasă etc.. Există mai multe variante ale metodei.

Prima varianta. Embrionul este fixat vertical cu capătul contondent în sus. În cochilie, pe partea embrionului, iar uneori pe partea opusă embrionului, la 5-6 mm deasupra marginii camerei de aer, se face o gaură cu un diametru de aproximativ 1 mm. Acul se introduce paralel cu axa longitudinală până la o adâncime de 10-12 mm (Fig. 16). După injectarea materialului care conține virusul, acul este îndepărtat, iar orificiul din carcasă este închis cu o picătură de parafină sterilă topită.

Figura 16. Infecția în cavitatea alantoidiană (prima variantă) (după Nicolau)

A doua varianta. Orificiul făcut în carcasă deasupra camerei de aer este folosit doar pentru a elibera o parte din aer. Orificiul pentru infecția în sine se face în zona zonei avasculare a membranei corioalantoide (CAO) din partea laterală a embrionului. Acul este introdus la o adâncime de cel mult 2-3 mm. Lichidul infectant se injectează într-un volum de 0,1-0,2 ml și se închide orificiul cu parafină (vezi Fig. 17).

Infecție pe membrana corionallantoică.

Această metodă de infectare a embrionilor de pui este folosită mai des pentru cultivarea virusurilor epiteliotrope și pantropice ale variolei, laringotraheitei aviare infecțioase, boala canină, boala Aujeszky, limba albastră etc.

O astfel de infecție poate fi efectuată printr-o cameră de aer naturală sau artificială.

Pentru infecție prin camera de aer natural embrionul este plasat într-un suport vertical cu capătul contondent în sus și se decupează în cochilie o fereastră rotundă cu diametrul de 15-20 mm pe centrul camerei de aer. Prin această fereastră, membrana cochiliei este îndepărtată cu o pensetă. Pe zona expusă a CAO se aplică 0,2 mm dintr-o suspensie care conține virus (Fig. 18), orificiul este închis cu bandă adezivă sau mai rar cu o sticlă de acoperire, întărindu-l cu parafină topită.

Infecţie printr-o cameră de aer artificială folosit mai des decât primul, deoarece asigură contactul materialului care conține viruși cu suprafata mai mare CAO și, prin urmare, duce la formarea mai multor virusuri.

Figura 17. Infecția unui embrion de pui în cavitatea alantoidiană (varianta a doua) (după Nicolau)

Figura 18. Infecția la CAO printr-o cameră de aer naturală (după Nicolaou și colab.)

Figura 19. Infecția unui embrion de pui pe CAO printr-o cameră de aer artificială (după Nicolau și colab.)

Pentru a infecta un embrion cu această metodă, acesta este plasat într-un suport orizontal, cu embrionul în sus. În carcasă se fac două găuri: una este mică deasupra centrului camerei de aer (proiectată pentru a aspira aerul din ea), iar cealaltă are 0,2-0,5 cm în diametru pe lateral, din partea embrionului. Complexitatea metodei constă în faptul că, atunci când se face cea de-a doua gaură, este necesar să se îndepărteze mai întâi cu grijă o bucată de carcasă, apoi cu o mișcare de alunecare, fără a deteriora CAO, se deplasează membrana învelișului în lateral, astfel încât aerul să poată trece. prin defectul format. După aceea, aerul este aspirat din camera de aer naturală prin primul orificiu cu un bec de cauciuc (Fig. 19, a), ca urmare, aerul exterior se precipită spre interior prin orificiul lateral, formând o cameră de aer artificială, partea inferioară. dintre care este HAO (Fig. 19, b).

Un fluid infecțios este aplicat pe suprafața CAO printr-o gaură laterală, iar orificiul este închis cu o bucată de bandă adezivă. Nu este nevoie să închideți prima gaură, deoarece stratul interior al membranei cochiliei nu este perturbat de această metodă de infecție și continuă să acționeze ca o barieră pentru microflora mediului.

Incubarea ulterioară a embrionilor infectați cu această metodă se efectuează în poziție orizontală, cu partea laterală în sus.

Infecție în sacul vitelin.

În cea mai mare parte, sunt utilizați pentru reproducerea chlamydia, precum și virușii bolii Marek, rinopneumonia cailor, limba albastră etc. Infectează embrioni de 5-7 zile și uneori de 2-3 zile (febra valei RIF). virus). Există două tipuri de infecție.

Prima varianta. Embrionii sunt plasați într-un suport în poziție verticală. Se face o gaură în carcasă deasupra centrului camerei de aer și acul este introdus la o adâncime de 3,5-4 cm la un unghi de 45 ° față de axa verticală în direcția opusă locației embrionului (Fig. 20).

Figura 20. Infecția embrionului de pui în sacul vitelin (după Nicolaou și colab.)

A doua varianta. Uneori, o cale similară de infecție este efectuată pe un embrion fixat orizontal într-un trepied; în timp ce embrionul este în partea de jos, iar gălbenușul este deasupra lui. Orificiul din carcasă se închide cu o picătură de parafină topită.

Infecție în cavitatea amniotică.

În acest scop se folosesc embrioni de 6-10 zile. Metoda este folosită în cultivarea virusurilor gripale, a bolii Newcastle, a rinoneumoniei ecvine etc. Există două moduri de infectare.

Calea închisă. Infecția se realizează într-o cutie întunecată. Oul este plasat pe ovoscop în poziție orizontală cu embrionul în sus. Un ac cu capătul contondent este introdus printr-o gaură din carcasă deasupra camerei de aer spre embrion. Dovada că acul a pătruns în amnios este mișcarea corpului embrionului în direcția mișcării.

Calea deschisă.Învelișul de deasupra camerei de aer este tăiat astfel încât să se formeze o fereastră cu diametrul de 1,5-2,5 cm, prin ea se îndepărtează membrana cochiliei cu o pensetă sub controlul ochiului. Apoi pensete anatomice (14 cm) cu fălcile închise sunt împinse prin membrana corioalantoidiană spre embrion. Când penseta ajunge la el, fălcile sunt deschise, membrana amniotică este capturată împreună cu CAO și trasă spre fereastră. Ținând penseta cu teaca amnionică fixată în ea cu mâna stângă, se introduce materialul care conține virusul (Fig. 21). În plus, toate cochiliile sunt coborâte, fereastra este închisă cu bandă adezivă și embrionul este incubat în poziție verticală.

Figura 21. Infecția embrionului de pui în amnios cale deschisă(conform lui Nikolaou et al.)

Infecția în vasele de sânge ale CAO.

La lumânarea embrionilor de 11-13 zile, se observă un vas de sânge mare. De-a lungul cursului său, o secțiune a cochiliei este îndepărtată, se aplică 1-2 picături de alcool, ceea ce face ca coaja să fie transparentă pentru un timp. Sub controlul ochiului de pe ovoscop, acul este introdus în vas, ceea ce este confirmat de mobilitatea sa cu mici mișcări laterale ale acului. Zona expusă a membranei învelișului este acoperită cu o bucată de bandă adezivă.

Este posibil să se introducă materialul în vase într-un mod ușor diferit: carcasa este tăiată deasupra camerei de aer, membrana învelișului este umezită cu alcool, iar materialul este introdus în vasele KAO care au devenit proeminente. Orificiul este închis cu o bucată de bandă adezivă sterilă.

Tehnicile descrise pentru infectarea experimentală a embrionilor de pui nu sunt singurele, dar au diverse opțiuni.

Infecție în corpul fătului.

Embrionii cu vârsta de 7-12 zile sunt utilizați pentru infecție. Sunt cunoscute două versiuni ale metodei.

Prima varianta. Se infectează la fel ca la amnios în mod închis, singura diferență fiind că iau un ac ascuțit iar pe ovoscop, supunerea embrionului la mișcările acului este considerată un indicator al pătrunderii acului. corpul.

A doua varianta. Ele infectează în același mod ca și în amnios în mod deschis: prin fereastra din coajă, corpul embrionului este tras cu penseta. Materialul este injectat în creier sau în anumite părți ale corpului. Cu astfel de metode de infecție, există un procent semnificativ de moarte nespecifică a embrionilor.

Acumularea virusului în embrionul de pui

Înainte de continuarea incubației, pe coaja embrionilor de pui infectați prin orice metodă, ei scriu cu un creion simplu (grafit) cu ce este infectat embrionul și când, și dacă este necesar, alte informații. Embrionii de pui infectați sunt plasați într-un termostat pentru incubare ulterioară, timp în care virusurile introduse se reproduc și se acumulează în structurile corespunzătoare. Temperatura de incubație a embrionilor variază de la 33 la 38 °C, în funcție de proprietățile virusului care a fost infectat. Embrionii sunt monitorizați în mod constant, priviți pe un ovoscop, selectând morții.

Moartea embrionilor în primele 24 de ore după infecție se datorează cel mai adesea reproducerii ciupercilor, microflorei bacteriene introduse în embrion împreună cu inoculul sau rănirii în timpul infecției. Acest deces este considerat nespecific. În mai mult întâlniri târzii embrionii mor ca urmare, de regulă, a reproducerii în embrionii virusului. După ce au găsit embrionii morți, aceștia sunt imediat transferați într-un frigider cu o temperatură de 4 °C. Astfel de condiții, pe de o parte, contribuie la păstrarea activității virusului acumulat în embrion, pe de altă parte, la compactarea țesuturilor și dezolarea vaselor de sânge, ceea ce facilitează foarte mult deschiderea ulterioară.

Embrionii sunt incubați până la acumularea maximă a virusului. Pentru fiecare virus și chiar tulpină, această perioadă este specifică și variază de la 2 la 7-8 zile. Deci, pentru virusul bolii Newcastle din tulpina H, este de 2-3 zile, pentru același virus din tulpina B, 5 zile, pentru virusul laringotraheitei infecțioase la păsări, 5 zile etc. Apoi toți embrionii sunt uciși prin răcire la 4 ° C timp de cel puțin 3-4 ore și deschis.

Ouă deembrinate.

Metoda se bazează pe îndepărtarea embrionului din ou în perioada în care membrana corionallantoică aderă complet la învelișul său din interior. Dacă în interiorul unui astfel de ou se adaugă un mediu nutritiv, atunci se formează un fel de cultură de țesut în care virusul se poate multiplica. Metoda are o serie de avantaje: face posibilă obținerea unui virus mai pur decât în ​​lichidul alantoico-amniotic, ceea ce este important pentru reducerea proprietăților alergene ale vaccinurilor preparate din acest material; absenta sacului vitelin si, in consecinta, a anticorpilor specifici continuti de acesta, permite unor virusuri sa se reproduca mai bine. În unele cazuri, această metodă dă rezultate bune în activitatea de diagnosticare, deoarece poate introduce cantități mari de material de testare, ceea ce crește posibilitatea izolării virusului.

Metoda a fost propusă de Bernkopf încă din 1949, dar din cauza dificultăților de aplicare, nu este utilizată pe scară largă. Aceste dificultăți sunt asociate cu capacitatea membranei corioalantoice de a se separa de coajă în timpul incubației, ceea ce reduce valoarea culturii și face dificilă manipularea producției de virus și înlocuirea mediului nutritiv.

E. Groyel (1963) a introdus o serie de modificări care au făcut posibilă eliminarea acestor dificultăţi. El a sugerat să se folosească ouă de 15 zile și chiar mai vechi, care ar trebui să fie întoarse frecvent în timpul incubației pentru a dezvolta uniform coaja de pe coajă. Când sunt translucide, limitele camerei de aer sunt indicate. Coaja este tăiată cu 0,5 cm deasupra acestei linii, parafina topită (56-58 ° C) este turnată pe marginea cochiliei, care, atunci când se solidifică, fixează marginea oului. Apoi, o gaură rotundă este tăiată în coajă deasupra embrionului, lăsând o margine îngustă în jurul acestuia. Etapa următoare- Îndepărtarea cu grijă a embrionului din ou. În acest caz, oul trebuie ținut în poziție orizontală și rotit încet. În acest fel, vasele care leagă embrionul cu CAO sunt găsite și tăiate cu foarfecele. Dacă oul este ținut vertical, atunci embrionul trage coaja cu masa sa, de obicei rupând-o în regiunea capătului ascuțit al oului. Pătrunderea chiar și a unei cantități mici de lichid între CAO și înveliș determină o detașare completă a învelișului în 1-2 zile.

După ce embrionul este îndepărtat, coaja care căptușește oul este spălată de mai multe ori cu soluție salină răcită la 4-0°C până când lichidul devine limpede. Apoi, 20 ml de mediu nutritiv încălzit la 37 ° C se introduc în cavitatea oului, iar oul este închis cu un capac steril de cauciuc, scufundat în prealabil în parafină. Un tub cu dop de cauciuc încorporat în ou permite atât colectarea, cât și administrarea lichidului fără riscul contaminării bacteriene. Un astfel de obiect biologic rămâne viabil timp de câteva zile.

Urmând metoda lui Yoshino et al., cavitatea ouălor deembrinate este umplută cu o soluție de agar în soluția lui Hank. Infectează ouăle deembrinate printr-un tub cu capac.

Întrebări de control:

1. Structura embrionului de pui.

2. De ce sunt folosiți embrionii de pui în virologie?

3. Care este structura unui embrion de pui în curs de dezvoltare?